也谈新型冠状病毒核酸检测 “假阴性”
新型冠状病毒也称严重急性呼吸综合征（SARS）冠状病毒-2，与2003年的SARS冠状病毒一样，由RNA核酸和蛋白等组成，RNA很容易降解，蛋白衣壳将RNA包裹在其中，加上一层由脂质和糖蛋白组成的包膜外衣，从而使其RNA得到保护。病毒通过特定细胞表面的受体入侵细胞造成感染，并且利用宿主细胞进行复制增殖。因此可以通过采集人的特定部位细胞样本，检测其中是否含有病毒RNA核酸，来确认机体是否受到感染。
核酸是由四种不同碱基排列而成，不同病毒的核酸碱基排列方式，就像发报的密电码，各有不同。检测RNA病毒核酸的最为常用的方法是实时荧光RT-PCR。病毒核酸测序则主要用于病毒序列分析、进化及变异研究。核酸检测就像分析密电码，新型冠状病毒也有其特异的密电码，但是总体与SARS冠状病毒相似度较高，达80%多，与其它冠状病毒也具有一定的相似性，与蝙蝠冠状病毒的核酸序列一致性最高，达95%以上。新型冠状病毒约3万个碱基，不同区域和其它冠状病毒的相似性有所不同，有些区域相似度高达90%以上，因此核酸检测试剂往往选择相似度低的区域进行，这样就可以特异地识别新型冠状病毒。区域的识别，通过引物和探针的结合来实现，因此试剂中的探针和相应区域的高度匹配决定了病毒核酸检测具有很好的特异性，一旦检测到，即为“阳性”，证明有病毒的存在。通常我们说病毒核酸检测是确诊感染的“金标准”，这个“金标准”就是指“阳性”结果。至于假阳性，则通常是由于实验室人员操作时，发生了标本间交叉污染或实验室扩增产物的遗留污染所致，在目前严格执行“三个阴性样本随机放在临床样本中间同时参与检测全过程”的质控策略下，可有效避免假阳性结果的报出，这也是“阳性”结果可以确诊的依据之所在。但另一方面，如果检测结果为“阴性”，则不能作为判断患者未被感染的“金标准”，原因如下。
在被感染者中检出核酸，需同时满足以下四个条件，即（1）被感染者的细胞中有一定量的病毒；（2）采集标本时，必须采集到含有病毒的细胞；（3）可靠的体外诊断试剂；（4）规范的临床核酸检测实验室（合理的分区、有能力的检测人员和严格的质量管理体系）。
目前网络上激烈讨论的临床医生反映强烈的核酸检测“假阴性”概念，往往指的是临床症状及影像学高度疑似病毒性肺炎，但新型冠状病毒核酸检测多次或始终为“阴性”。但对于核酸检测试剂和临床实验室而言，核酸检测“假阴性”概念则有所不同，前者指的是所采集样本中存在有足够量的病毒，但却没有被检出，而不是上述临床医生所称的核酸检测结果与临床表现不符的“假阴性”。
要想尽可能避免“假阴性”，首先要解决的是“被感染者的细胞中有一定量的病毒、采集标本时采集到含有病毒的细胞”这两个环节的问题。
（1）被感染者的细胞中有一定量的病毒：机体被病毒感染后，病毒通过鼻腔和口腔进入到咽喉部，再到气管和支气管，进而到达肺泡，感染者会经历潜伏期、轻度症状、再到严重症状的过程，不同病程阶段以及机体不同部位存在的病毒量有所不同，是因为这些部位细胞所含病毒受体占比不同所致。新型冠状病毒感染，肺泡上皮细胞的病毒受体表达占比最高，气道上皮细胞、成纤维细胞、内皮细胞和巨噬细胞等则占比极低。因此，下呼吸道的病毒量明显高于上呼吸道。呼吸道病毒检出可能性又高于血液。此外，在疾病发展过程中，粪便也有较大可能出现病毒，因为研究发现消化道细胞也表达有病毒受体，一些患者有腹泻症状，不排除粪-口传播途径。总之，肺泡灌洗液中最容易检出病毒核酸，其次是深咳痰，再是鼻咽部，再次是口咽部。因为操作的方便性和患者的接受程度，目前临床最常用的标本是口咽部拭子，其次是鼻咽部拭子，而在某些患者中，口咽部或鼻咽部细胞中病毒量较少或极低，如果只取口咽部或鼻咽部标本检测，病毒核酸就检测不到。尽管肺泡灌洗液更容易检出核酸，由于其操作的复杂性，难以作为常规采样方法。此外，新冠肺炎患者通常为干咳，痰标本也较难得到。因此，一个特定的疑似感染的患者，不同的病期，在不同的身体部位出现病毒的浓度会有差异，如咽部没有，却可能粪便中有，如能同时或在疾病过程中的不同时间采取上述多种标本进行检测，会有助于“假阴性”的避免。
（2）标本采集时要采集到含有病毒的细胞：理论上说，目前的注册试剂都包含检测人细胞的序列“内标”，如含有一个单链RNA分子的RNase P。“内标”可以监测是否采集到足够量的细胞。但是，采集部位不当，如采集口咽拭子时，采集深度不够；采集鼻咽拭子没有采到鼻腔深处等，可能采集到的细胞绝大部分都是不含病毒的细胞，即可能造成“假阴性”。通过加强对标本采集人员的培训，可以在很大程度上解决该问题。
（3）可靠的体外诊断试剂：体外诊断试剂的可靠性非常重要，如前所述，拟检测的病毒核酸区域的选择极为关键。为了提高检测的敏感性，多数厂家选择病毒核酸序列的两个或两个以上的区域进行检测，在前期调研中，也发现实际检测中，存在一定比例单个靶区域阳性的结果，说明试剂对不同区域的敏感性确实存在差异，也可能是双靶标或三靶标之间的相互竞争作用所致。此外，试剂反应条件、反应体系、核酸加入量等都是可能影响检测分析敏感性的因素。部分厂家的试剂产品由于试剂厂家研发时间短，也没有使用已知临床样本进行必要的性能确认，可能存在对试剂优化不充分以及试剂批间差异大等问题。通过从国家层面开展试剂的检测性能评价研究，探讨存在的问题，可以进一步改进试剂质量，提高分析敏感性。此外，临床实验室可对每批试剂采用保存的已知几份阴性和阳性样本进行使用前的质检，也是一种有效的措施。但试剂的分析敏感性是有极限的，其通常是在采集的样本中取一部分进行核酸提取，提取后再取一部分进行检测。因此，在样本中寻找病毒，就像在一本百万字的书里寻找错别字，理论上说，即使只有一个错别字也可以被发现；但实际上，由于成本和时间等的限制，只能从中随机抽取10万或者20万字进行查找，如果错别字数较少，就有可能不在被抽取的字数当中，因此无法找到。同样的，样本中病毒数量低于一定程度，试剂也就无法检出。因此，从这个层面上看，病毒核酸检测的“假阴性”是无法完全避免的。
（4）规范的临床实验室：标本运输保存条件、临床实验室的规范操作、结果判读和质量控制等也是保证检测结果准确可靠的关键因素。通过加强对实验室人员的培训，不断完善实验室质量管理体系，可以减少因实验室检测操作层面出现的“假阴性”。
综上所述，已被感染的患者有些不能检出病毒核酸，与临床表现不符，这种“假阴性”无法完全避免，但是不是就一点别的办法都没有了呢？不是的。目前一个行之有效的办法，就是补充新型冠状病毒特异抗体检测。抗体是机体感染病毒后，体液免疫应答的产物。通常，IgM抗体在感染早期出现，IgG抗体在感染中晚期出现，滴度有一个持续增高的过程，并在血液循环中保持较长时间存在。简言之，检测特异抗体也可以明确患者是否“近期或既往感染过新型冠状病毒”，有助于核酸检测阴性但临床上疑似患者的确诊。抗体检测对临床实验室的操作要求相对于核酸检测要低，可以快速、大量检测，且可以在基层实验室完成。但要说明的是，特异抗体检测阳性不能像病毒核酸检测阳性一样作为病毒感染的“金标准”，因为抗体检测容易受到血液标本中的一些干扰物质（如类风湿因子、非特异IgM、溶血所致的高浓度血红蛋白等）的存在而出现“假阳性”结果，所以抗体检测必须采用IgM和IgG同时检测且通常需多次动态检测来确认，IgM/IgG初次检测可能出现的结果有IgM(+)/IgG(-)、IgM（+）/IgG(+)、IgM(-)/IgG(+)和IgM(-)/IgG(-)四种模式，可按图1所示流程进行检测以判断患者是否为急性或近期感染。
图1.IgM/IgG检测策略及结果解释
参考文献（略）
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